Образцы светильников: Как получить образцы светильников PromLED

7 трендов и 25 светильников • Интерьер+Дизайн

 

Светильник Drop, диз. Линдси Эйдельман. Основа — латунные стержни, плафоны — выдувные стеклянные шары. «Я хотела бросить себе вызов, — говорит дизайнер. — И найти дикий, энергичный драйв через этот процесс, играя с формами».

Светильник Alabaster Totem 16, диз. Allied Maker. Торшер-тотем демонстрирует красоту материала, популярного в античности. Конструкция подчеркивает его полупрозрачность, создает деликатное сияние.

Светильник Cirrus, Coil + Drift. Два источника света на U-образной основе транслируют идею баланса. Каждый с прозрачным «плафоном» из литой смолы.

Светильник Oracle, диз. Джулия Даулт и Кристофер Стюарт. Модель с отогнутым краем выполнена из полированной бронзы, покрытой перламутровой краской.

Светильник, диз. Crosby Studios, Opening Ceremony. Источники вдохновения — реплика кресла-ладони Hand Chair Педро Фридеберга, которую Гарри Нуриев нашел возле своей нью-йоркской квартиры, и светильники Сержа Муя.

Светильник Cé Wall, D’Armes. Лаконичным линиям, характерным для работ бренда, добавили декоративности. Металл соединили с бахромой из вискозы, создающей «роскошную атмосферу».

 

Светильники Par, диз. Андреас Бергсакер, Trueing Studio. Каждая модель состоит из двух частей: одна оснащена светодиодами, вторая отражает свет. Основной материал — древесина пихты Дугласа.

 

Светильники Oo, диз. Эни Ли Паркер. Круглые плафоны покоятся на необычных опорах, выполненных из керамики.

Дизайнеры создают эффектные светильники, экспериментируя с формой и материалом. Лаконичные модели не сдают позиций, но уже не столь аскетичны: простые линии соединяют с декоративными элементами. Помимо стекла и металла авторы используют керамику, древесину, травертин, акрил, полимерные смолы и текстильную бахрому.

Новые модели выразительны как при включенном, так и при выключенном свете.

По теме: Топ трендов интерьерного дизайна для миллениалов

Светильник Aries, диз. Бек Бриттен и Джон Хоган. Результат коллаборации дизайнеров. Стеклянные элементы навеяны звездами из созвездия Овна, а металлические — архитектурой. Лимитированное издание, 10 экз.

1. Мягкое золото. Мягкая матовая отделка абажуров или каркасов — это надолго. Они могут сочетаться практически с любым видом декора, от современного до традиционного. Компаньоны: вещи других мягких оттенков, таких как серый или матовый серебристый. 

2. Изысканное ретро. Промышленное освещение, светильники, напоминающие те, которые выпускались для фабрик, заводов и вокзальных станций XX века — безусловный мейнстрим. «Индустриальный модернизм» и просто ретро сегодня отличаются более тонкими деталями, приближая их к произведниям искусства. Для просто любителей ностальгического дизайна — винтажные лампочки Эдисона, но в современном светодиодном освещении, для эстетов — настольные конторские лампы, переосмысленные модным неоновым свечением.

 

Светильники Liquid Collusion, диз. Гарри Нуриев и Лиам Гиллик. Коллекция объединяет металлические каркасы, которые часто использует Гарри Нуриев, и стеклянные панели — любимый материал Лиама Гиллика.

Светильник Phase, диз. Ким Маркел, Kin & Company. Строгая металлическая рама и яркая декоративная вставка: слои акрила и смолы.

Светильник Exhale the Void, диз. Райан Ханрахан, Addition Studio. Корпус вырезан из бежевого травертина. Его части подвижны, чтобы отрегулировать направление света.

Светильник Charlotte, диз. Федерико Пери, Nilufar Gallery. Комбинация боросиликатного стекла с градиентов и полированной латуни.

Настенные светильники из колл. Kyoto, Atelier de Troupe. Для использования как дома, так и на улице. Скульптурный корпус отлит из алюминия в песчаной форме. Отделка — латунь, бронза, серебро или чернение.

3. Ар-деко и Mid-century modern. По какой-то причине декоративные светильники только сейчас отвечают этим тенденциям, укоренившимся в предметном и интерьерном дизайне. «Новое средневековье» — это переосмысление лучших дизайнерских образцов с 1920-х по 1970-е годы. Чистые линии, уникальные конструкции, баланс формы и искусства. Геометрия, мобили и красивая линия, но в новых материалах для корпуса и со светодиодными источниками света. Важный момент: при выключенном свете светильник должен выглядеть как абстрактное произведение искусства. Никак не меньше.

Светильники Nebulae, диз. Росс Гардам. Основной материал — рифленое стекло. По мнению дизайнера, за счет полупрозрачности оно эффектно даже при выключенном свете.

4. Меньше беспорядка. Современный декор основан, в основном, на чистых формах. Будь то современный диван, современная кухня или современное освещение, чрезмерное украшение потеряло остроту. В моде цитировать функционалистов и рационалистов. Тенденция минимализма станет еще более популярной в 2019 году, когда на рынок выйдут светильники с низкопрофильным креплением. Они ориентированы на простые геометрические конструкции, нейтральные мягкие цвета.

Periplo, диз. Дарио Де Мео и Лука Де Бона, Karman. Декоративная решетка «защищает воспоминания, впечатления и сохраняет их в безопасности. Свет может изменить атмосферу мест, где мы живем, повлиять на восприятие эмоций и воспоминаний».

5. Доступные светодиоды. Лампы накаливания расточительны: большая часть энергии теряется в виде тепла. Вот почему случился скачок к переходу на другие, более эффективные и экологически чистые типы освещения. Еще одним преимуществом светодиодного освещения является разнообразие доступных стилей, оттенков, яркости, форм и т. д. Главный фактор популярности — снижение цены.

Светильник Mile 03, Lambert & Fils. Дизайнеры переосмыслили привычные светильники, которые обычно используются в офисах, и придали модели скульптурную форму.

Светильник Chord Custer, диз. Alex Allen Studio. Источники вдохновения — минималистичные ювелирные украшения и полукруглые ярусы хрустальной люстры с подвесками.

Светильник Circus, Resident Studio. Осветительные элементы выполнены в виду цепи, тогда как образ опоры заимствован у подставок под ювелирные украшения.

6. Светильник как бижу. Акцентный свет и светильники, рассчитанные на «wow»-эффект, не выходят из моды. Сегодня их делают похожими на ювелирные украшения, при этом основной стиль — архитектурный минимализм. В приоритете или размер XXL или, наоборот, микромасштаб — светильник для камерного пространства, «на один ноутбук». 

7. Модули. Важный тренд — стремление к разнообразию и удовлетворению индивидуальных потребностей — отражает кастомизированный предмет, т.е. предмет, способный меняться, настраиваться на пользователя. Как это выражается в обычных, не обязательно высокотехнологичных, продуктах? Инженеры вспомнили о модульных конструкциях.

Один элемент мультиплицируется и может составлять системы самой разнообразной конфигурации и назначения.

По теме: Главный тренд Salone del Mobile

Система светильников Legato, диз. Лука Никетто, Matter Made. Название коллекции дал музыкальный прием легато, при котором один звук плавно переходит в другой. Элементы системы позволяют по-разному соединять отдельные модули.

 

Система светильников Legato, диз. Лука Никетто, Matter Made.

Система светильников Legato, диз. Лука Никетто, Matter Made.

 

 

Светильники ЖКХ: сравнение заявленных параметров и реальных

Светильники ЖКХ можно увидеть у подъездов жилых домов, на лестничных пролетах или в технических помещениях. У покупателей к ним немного требований: экономичность и надёжность. Однако указанные на упаковке параметры не всегда совпадают с реальными.

На что обращать внимание при выборе ЖКХ светильника?

В отличие от лампочек, светильники ЖКХ заменить не так легко. Поэтому, чтобы не менять светильник каждые полгода стоит обратить внимание на параметры, которые напрямую влияют на качество и продолжительность работы светильника.

• Тип драйвера. Драйвер защищает светодиоды от перепадов напряжения и обеспечивает им продолжительный срок службы.
• Герметичность. От плотности проклейки рассеивателя к корпусу зависит класс защиты светильника от влаги и пыли.
• Материал корпуса. Вторсырье в составе корпуса делает его хрупким, а нарушение целостности корпуса влияет на герметичность светильника.

Стоит также обратить внимание на энергоэффективность светильника и угол рассеивания: первый позволит не переплачивать за электроэнергию, а второй — создать качественное освещение. Цветовая температура имеет значение, если светильник будет установлен в помещении, где постоянно находятся люди, а если вас волнует эстетический вид светильника, то не лишним будет убедиться, что на лицевой стороне креплений предусмотрены заглушки.

Всегда ли реальные характеристики светильников ЖКХ соответствуют тому, что написано на упаковке? 

Чтобы ответить на этот вопрос, мы закупили образцы светильников шести разных торговых марок, представленных в розничных магазинах Украины: 

• AVT, 12W, 6000K, 1100LM
• CRYSTAL, 20W, 6500K, 1600LM
• ELM, 12W, 6000K, 900LM
• VESTUM, 12W, 4500K, 1200 LM
• LEBRON, 8W, 4100K, 720LM
• VIDEX, 12W, 5000K, 1050LM

Мы отправили их в фотометрическую лабораторию, где были измерены основные светотехнические характеристики. Их мы сверили с теми, что указаны на упаковке.  Чтобы результаты тестирования были понятны, мы занесли их в таблицу и составили краткий обзор для каждого светильника. Красным цветом отмечены значительные отклонения измеренных параметров от заявленных параметров. Цена светильников взята с официальных сайтов производителей и указана в долларах в справочных целях.  

Название	VESTUM		LEBRON		VIDEX
Параметры	Заявлено	Измерено	Заявлено	Измерено	Заявлено	Измерено
Мощность, Вт	12	12.1	8	7.5	12	11.4
Цветовая температура, °К	4500	4005	4100	4155	5000	5193
Световой поток, Лм	1200	1215.8	720	760.5	1050	1069.4
Энергоэффективность, Лм/Вт	100	100.1	90	101.5	87	93.7
Угол рассеивания, °	120	125	140	125	120	125
Драйвер	IC Constant		IC Constant		IC Constant
Розничная цена, $	4,8		3,5		5,8
Цена за 100 Лм, $/Лм	0,4		0,46		0,58

VESTUM

Энергоэффективность — 100,1 Лм/Вт. Все показатели, кроме цветовой температуры, указаны точно. Цветовая температура ниже заявленной на 11%, но находится в заявленном нейтральном диапазоне цвета.

Корпус выполнен из первичного ABS пластика, о чём свидетельствует его чистый белый цвет. Рассеиватель закреплён большим количеством силикона и обеспечивает герметичность соответственно уровню защиты IP65.  В светильнике используется IC драйвер constant, который обеспечивает работу в широком диапазоне напряжения 110-265 В. В комплект входят крепления и декоративные заглушки. Розничная цена — 4,8 $.

Светильник VESTUM, 12W, 4500K, 1200 LM подходит для установки в пыльных или влажных помещениях и устойчив к перепадам напряжения в сети. При низкой цене, по параметрам он соответствует более дорогим аналогам.  

LEBRON

Энергоэффективность светильника — 101.5 Лм/Вт. Все характеристики этого светильника указаны с допустимой погрешностью.

Корпус светильника выполнен из вторичного пластика, о чём свидетельствует его цвет. При установке такой корпус может дать трещину. Рассеиватель закреплён большим количеством силикона, что обеспечивает достаточную герметичность и соответствует уровню защиты IP54. В комплект входят крепления. В светильнике используется IC драйвер constant, который обеспечивает стабильную работу в диапазоне напряжения 170-260 В. Розничная цена — 3.5$.

Светильник LEBRON, 8W, 4100K, 720LM подходит для установки в запылённых помещениях и выдержит попадание брызг воды на корпус. Он устойчив к перепадам напряжения, но может дать трещину при установке. Имея самую высокую цену, светильник не имеет самые высокие характеристики среди выбранных моделей.

VIDEX

Энергоэффективность светильника — 93.7 Лм/Вт. Все характеристики указаны с допустимой погрешностью.

Корпус светильника выполнен из первичного ABS пластика, о чём свидетельствует его чистый белый цвет. Рассеиватель крепится к корпусу большим количеством силикона, что делает светильник герметичным и соответствует уровню защиты IP65. В комплект входят крепления. В светильнике используется IC драйвер constant, который обеспечивает работу в диапазоне напряжения 100-265 В. Розничная цена — 5,8$.

Светильник VIDEX, 12W, 5000K, 1050LM соответствует заявленным параметрам, подходит для работы в пыльных или влажных помещениях и устойчив к перепадам напряжения в сети. Высокое качество этого светильника подтверждается его ценой.

 

Название	AVT		CRYSTAL		ELM
Параметры	Заявлено	Измерено	Заявлено	Измерено	Заявлено	Измерено
Мощность, Вт	12	11	20	17.5	12	11.7
Цветовая температура, °К	6000	6330	6500	6861	6000	6326
Световой поток, Лм	1100	1004. 6	1600	1271.7	900	1201.1
Энергоэффективность, Лм/Вт	91	91.1	80	72.5	75	102.5
Угол рассеивания, °	160	125	180	125	120	125
Драйвер	Linear IC DoB		IC Constant		IC Constant
Розничная цена, $	4,8		3,5		5,8
Цена за 100 Лм, $/Лм	0,4		0,46		0,58

AVT

Эффективность светодиодов этого светильника – 91 Лм/Вт. Угол излучаемого света 122°, что на 22% ниже заявленного — это серьёзное отклонение. Остальные параметры указаны с допустимой погрешностью.

Светильник выполнен из вторичного пластика, что заметно по цвету корпуса. Вторичное сырьё в составе делает корпус хрупким, при установке он может дать трещину. Рассеиватель приклеен не герметично, использован обычный клей, поэтому светильник не соответствует заявленному классу защиты от влаги и пыли IP65. В комплекте светильника отсутствует крепление. В светильнике используется – линейный DoB драйвер. С таким типом драйвера светильник может работать только в узком диапазоне напряжений (220 — 240В). Розничная цена — 5.26$.

Светильник AVT, 12W, 6000K, 1100LM – конструктивно самый простой и бюджетный тип светильника. Не подходит для работы в сетях с перепадами напряжения. Цена на этот светильник неоправданно завышенная.

CRYSTAL

Измеренная мощность светильника на 12% ниже заявленной, как и световой поток. Угол рассеивания света составляет 125° и на 31% меньше заявленного. Остальные отклонения находятся в пределах допустимого. Стоит отметить, что низкая энергоэффективность этого светильника (72 Лм/Вт) свидетельствует о бюджетности использованных в драйвере компонентов.

Светильник выполнен из вторичного пластика, который придаёт корпусу серый оттенок и делает его хрупким. При установке корпус может дать трещину. Рассеиватель из PVC закреплён небольшим количеством силикона, из-за чего герметичность не соответствует уровню защиты IP54. В комплект входят крепления и декоративные заглушки. В светильнике используется IC драйвер constant, который обеспечивает работу в диапазоне напряжения 175-265 В. Розничная цена — 4.26$.

Данный светильник имеет низкую цену, низкую энергоэффективность и сильно завышенный угол рассеивания. Светильник будет бюджетным вариантом для сферы ЖКХ, но стоит учитывать хрупкость корпуса при установке. 

ELM

Измеренная энергоэффективность светильника — 102.5 Лм/Вт. Световой поток светильника на 33% превышает завяленный показатель. Остальные отклонения находятся в пределах нормы.

Светильник выполнен из вторичного пластика, что делает его хрупким. При установке корпус может дать трещину. Рассеиватель закреплён недостаточным количеством силикона и не обеспечивает герметизацию, соответствующую уровню IP54. В комплект входят крепления. В светильнике используется IC драйвер constant, который обеспечивает работу в диапазоне напряжения 175-250 В. Розничная цена — 4.94$.

Светильник ELM, 12W, 6000K, 900LM не подходит для установки в запылённых помещениях или в помещениях с повышенной влажностью. Корпус хрупкий и может дать трещину при установке. Устойчив к небольшим перепадам напряжения. Цена светильника соответствует его параметрам и качеству сборке. 

 

Какой светильник выбрать?

Часто цена является решающим фактором при покупке светильника. Однако сравнивать по стоимости выбранные светильники было бы некорректно, поскольку они потребляют разное количество Ватт и производят разное количество Люменов. Поэтому, для удобства мы сравнили стоимость 100 Люменов в каждом из светильников.

У светильника Vestum самые дешёвые Люмены среди всей выборки. В нём используется драйвер IC Constant, корпус выполнен из первичного ABS пластика, а рассеиватель герметично закреплён силиконом. Поэтому светильник Vestum — лучший выбор по соотношению цена-качество.

	Vestum	Videx	Lebron	ELM	Crystal	AVT
Соответствие уровню защиты IP	✓	✓	✓
Устойчив к перепадам напряжения в сети	✓	✓	✓	✓	✓
Энергоэффективность выше 90 Лм/Вт	✓	✓	✓	✓		✓
Корпус из ABS-пластика	✓	✓
Розничная цена светильника, $	4,8	3,5	5,8	5.03	5,14	4.96
Цена за 100 Лм, $/Лм	0,4	0,46	0,58	0,5	0,42	0,41

 

Производитель светодиодных светильников и систем естественного освещения- Keosvet.

ru

• Каталог

Уважаемые партнеры и заказчики!
В связи с нестабильной ситуацией, просим уточнять цены на продукцию у наших менеджеров. Благодарим за понимание.

Производим

Производим светильники в соответствии с современными стандартами качества

Проектируем

Рассчитываем модели освещения для проектов любой сложности с разработкой необходимой документации

Продаем

Мы являемся дилерами крупных российских и европейских производителей осветительного оборудования

Доставляем

Доставляем светодиодное оборудование по всей России

• Хиты продаж
• Спецпредложения

Наши проекты

Отзывы

• — Сергеев С., главный энергетик бизнес-центра «Даниловская мануфактура», г. Москва

  Как главный энергетик «Даниловской мануфактуры», высоко оцениваю профессиональные слаженные действия специалистов компании «Кеосвет».

  Нужно было поменять освещение в одном из офисов в нашем бизнес-центре, но не просто сменить на обычные светильники, а найти дизайнерское решение. Парни из «Кеосвет» предложили зигзагообразные светильники своего производства, всё рассчитали, произвели монтаж, заменили старые лампы, сократив общее количество светильников. Всё сделано профессионально, под ключ, работает без проблем. А выглядит очень круто!
  подробнее о проекте …
  

• — ООО «ПромТехМонтаж-Диагностика», г. Ярославль

  Хотим выразить благодарность компании «Кеосвет» за оперативную помощь с освещением! У нас в старых цехах было очень темно, светильники стояли старые, разных цветовых температур. Света не хватало вообще. Мастера «Кеосвета» приехали, сделали все замеры, осуществили светотехнический расчёт. Привезли нам новые светодиодные светильники, освещение стало во-первых ярче и ровнее, а во-вторых – экономичней.

  Счета за электроэнергию теперь ниже. Будем обязательно обращаться ещё, рекомендуем!

• — ФОК «Легенда», г. Домодедово

  Очень понравилось сотрудничество с компанией «Кеосвет». Проблема была в правильной замене перегоревшего осветительного оборудования, необходимо было, чтобы новые светильники были ярче предыдущих, а по мощности – слабее. Светотехнический расчёт специалисты «Кеосвет» провели очень быстро, привезли светильники и оставили их нам на пробу. Мы несколько недель пользовались новым оборудованием, остались очень довольны. Закупку провели только после таких испытаний, очень удобно – так мы точно знали, что нам эти светильники подходят. Отличный профессиональный подход, всем бы так!
  подробнее о проекте …
  

• — Завод «Европласт», г. Москва

  Спасибо компании «Кеосвет», теперь у нас стоит современное осветительное оборудование. Значительно сократились расходы на электроэнергию, в цехах стало гораздо светлее. Отличные специалисты, вообще никаких претензий, привезли нам образцы светильников, оставили на тестирование, и покупку всего оборудования мы у них совершили после нескольких недель тестов. Оперативно и без проблем работают, очень рады, что нашли таких настоящих профессионалов! 
  подробнее о проекте …
  

Обзоры и советы

Все обзоры

30.07.2019 Дизайнерские светильники KEOSVET 16.07.2019 Подсветка фасадов и зданий 15.07.2019 Проект аварийного освещения 14.07.2019 Освещение торгового зала 13.07.2019 Освещение аптеки

Новости

Все новости

20 августа 2019 Компания Signify установила интегрированную систему освещения 19 августа 2019 Китай держит курс на солнце 14 августа 2019 Солнечные надувные фонари

Все новости

Обзоры и советы

Все обзоры и советы

Дизайнерские светильники KEOSVET Подсветка фасадов и зданий Проект аварийного освещения

Все обзоры и советы

Тест RT-LAMP без экстракции в режиме реального времени на SARS-CoV-2 в образцах из носоглотки, носа и слюны «от образца к ответу»: последствия и использование для эпиднадзора

Сохранить цитату в файл

Формат: Резюме (текст)PubMedPMIDAbstract (текст)CSV

Добавить в коллекции

• Создать новую коллекцию
• Добавить в существующую коллекцию

Назовите свою коллекцию:

Имя должно содержать менее 100 символов

Выберите коллекцию:

Не удалось загрузить вашу коллекцию из-за ошибки
Повторите попытку

Добавить в мою библиографию

• Моя библиография

Не удалось загрузить делегатов из-за ошибки
Повторите попытку

Ваш сохраненный поиск

Название сохраненного поиска:

Условия поиска:

Тестовые условия поиска

Эл. адрес: (изменить)

Который день? Первое воскресеньеПервый понедельникПервый вторникПервая средаПервый четвергПервая пятницаПервая субботаПервый деньПервый будний день

Который день? ВоскресеньеПонедельникВторникСредаЧетвергПятницаСуббота

Формат отчета: SummarySummary (text)AbstractAbstract (text)PubMed

Отправить максимум: 1 шт. 5 шт. 10 шт. 20 шт. 50 шт. 100 шт. 200 шт.

Отправить, даже если нет новых результатов

Необязательный текст в электронном письме:

Создайте файл для внешнего программного обеспечения для управления цитированием

. 2022 25 февраля; 17 (2): e0264130.

doi: 10.1371/journal. pone.0264130. Электронная коллекция 2022.

Кэтрин А Кундрод ¹ , Мэри Э. Натоли ¹ , Меган М Чанг ¹ , Челси А. Смит ¹ , Сай Пол ¹ , Дерек Огое ² , Кристофер Го ² , Акшая Сантханарадж ² , Энтони Прайс ³ , Карен В. Элдин ⁴ , Кейур Патель ⁵ , Эллен Бейкер ³ , Кэтлин М. Шмелер ³ , Ребекка Ричардс-Кортум ¹

Принадлежности

• ¹ Факультет биоинженерии, Университет Райса, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.
• ² Rice 360° Institute of Global Health, Университет Райса, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.
• ³ Отделение гинекологической онкологии и репродуктивной медицины, Онкологический центр им. М. Д. Андерсона Техасского университета, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.
• ⁴ Медицинская школа Макговерна, Центр медицинских наук Техасского университета, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.
• ⁵ Отделение гематопатологии, Онкологический центр им. М.Д. Андерсона Техасского университета, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.

• PMID: 35213596
• PMCID: PMC8880874
• DOI: 10. 1371/journal.pone.0264130

Бесплатная статья ЧВК

Кэтрин А. Кундрод и др. ПЛОС Один. 2022 .

Бесплатная статья ЧВК

. 2022 25 февраля; 17 (2): e0264130.

doi: 10.1371/journal.pone.0264130. Электронная коллекция 2022.

Авторы

Кэтрин А Кундрод ¹ , Мэри Э. Натоли ¹ , Меган М Чанг ¹ , Челси А. Смит ¹ , Сай Пол ¹ , Дерек Огое ² , Кристофер Го ² , Акшая Сантханарадж ² , Энтони Прайс ³ , Карен В. Элдин ⁴ , Кейур Патель ⁵ , Эллен Бейкер ³ , Кэтлин М. Шмелер ³ , Ребекка Ричардс-Кортум ¹

Принадлежности

• ¹ Факультет биоинженерии, Университет Райса, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.
• ² Rice 360° Institute of Global Health, Университет Райса, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.
• ³ Отделение гинекологической онкологии и репродуктивной медицины, Онкологический центр им. М. Д. Андерсона Техасского университета, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.
• ⁴ Медицинская школа Макговерна, Центр медицинских наук Техасского университета, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.
• ⁵ Отделение гематопатологии, Онкологический центр им. М.Д. Андерсона Техасского университета, Хьюстон, Техас, Соединенные Штаты Америки.

• PMID: 35213596
• PMCID: PMC8880874
• DOI: 10.1371/journal.pone.0264130

Абстрактный

Глобальный COVID-19Пандемия выявила необходимость в быстрых, точных и доступных тестах на нуклеиновые кислоты, чтобы обеспечить своевременную идентификацию инфицированных людей. Мы оптимизировали тест нуклеиновой кислоты «образец-ответ» на SARS-CoV-2, который дает результаты менее чем за 1 час с использованием недорогих и легкодоступных реагентов. Рабочий процесс теста включает простой протокол лизиса и вирусной инактивации с последующей прямой изотермической амплификации вирусной РНК с использованием RT-LAMP. Анализ был подтвержден с использованием двух разных приборов, портативного изотермического флуориметра и стандартного термоциклера. Результаты анализа RT-LAMP сравнивали с традиционной RT-qPCR для мазков из носоглотки, мазков из носа и слюны, взятых у когорты пациентов, госпитализированных из-за COVID-19.. Для всех трех типов образцов положительное согласие с RT-LAMP, выполненным с использованием изотермического флуориметра, составило 100% для образцов с Ct <30 и 69-91% для образцов с Ct <40. После проверки тест был успешно масштабирован для проверки слюны до 400 бессимптомных людей в день в рамках программы наблюдения в кампусе Университета Райса. Успешная разработка, валидация и масштабирование этого теста RT-LAMP в режиме реального времени без выделения образца для ответа на SARS-CoV-2 добавляет легко адаптируемый инструмент к усилиям по контролю COVID-19. пандемии и может информировать о стратегиях разработки тестов для будущих угроз инфекционных заболеваний.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Цифры

Рис. 1. Рядом с местом оказания медицинской помощи и высокая пропускная способность от выборки до ответа…

Рис. 1. Рабочие процессы рядом с местом оказания медицинской помощи и высокопроизводительные рабочие процессы «от образца до ответа».

(A-F) Рабочий процесс рядом с местом оказания медицинской помощи. (А) Оборудование и…

Рис. 1. Рабочие процессы «от образца к ответу» с высокой пропускной способностью и рядом с местом оказания медицинской помощи.

(A-F) Рабочий процесс рядом с местом оказания медицинской помощи. (A) Оборудование и расходные материалы, необходимые для проведения анализа RT-LAMP, включая пробирки для сбора и лизиса слюны, нагревательный блок, пипетки, минеральное масло и настольный флуориметр. Мазок из носа и трубка для лизиса (вставка) могут заменить материалы для сбора слюны. Для проведения теста (B) берут мазок из носа или образец слюны и смешивают с лизисным буфером, затем (C) образец нагревают при 95°C в течение 5 (назально) или 6 (слюна) минут. (D) Затем лизированный образец добавляют к реагентам RT-LAMP, а (E) реакционные смеси герметизируют и помещают в настольный флуориметр и нагревают при 65°C в течение 45 минут с мониторингом флуоресценции в реальном времени. (F) Результаты отображаются после полного инкубационного периода. (GM) Высокопроизводительный рабочий процесс слюны. (G) Расходные материалы и пипетки, необходимые для проведения анализа RT-LAMP, за исключением расходных материалов для робототехники Hamilton. Для проведения теста (H) буфер для лизиса и (I) слюна объединяются и (J) нагреваются при 95°С в течение 6 минут. (K) Мастер-микс RT-LAMP готовится и добавляется в 96-луночный планшет. (L) Инактивированные образцы добавляются в мастер-микс RT-LAMP с помощью установки Hamilton MicroLab Prep. Планшет запечатывают и (M) помещают на Bio-Rad CFX96 для амплификации и обнаружения. Результаты анализируются в программном обеспечении Bio-Rad Maestro.

Рис. 2. Оценка и оптимизация лизирующего буфера.

Рис. 2. Оценка и оптимизация лизирующего буфера.

Четыре концентрации лизирующего буфера (1X, 2X, 5X и…

Рис. 2. Оценка и оптимизация лизирующего буфера.

Были оценены четыре концентрации лизирующего буфера (1X, 2X, 5X и 10X) с 200 мМ GuHCl и без него. Буферы-кандидаты объединяли с элюатом отрицательного мазка из носа, добавляли псевдовирус Zeptometrix и нагревали при 95°C в течение 5 минут. (A) Средние значения Ct, полученные из лизированных образцов, амплифицированных в анализе CDC N1 RT-qPCR после очистки колонки (± стандартное отклонение; n = 6 для каждого условия). Значимость определена с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки. (B) Средние относительные значения флуоресценции из лизированных образцов в 1-часовой момент времени анализа предупреждения о РНКазе (± стандартное отклонение; n = 3 для каждого условия). Значимость определена с использованием двустороннего дисперсионного анализа. **** указывает р

Рис. 3. Предел обнаружения в отрицательном…

Рис. 3. Предел обнаружения в отрицательной объединенной матрице.

Предел обнаружения был оценен…

Рис. 3. Предел обнаружения в отрицательной объединенной матрице.

Предел обнаружения оценивали путем добавления псевдовируса Zeptometrix в объединенный матрикс носоглотки, собранный в буфере для лизиса, который ранее дал отрицательный результат на SARS-CoV-2 в RT-qPCR с использованием анализа CDC, или в объединенную слюну с отрицательным результатом в сочетании с буфером для лизиса. Образцы инактивировали нагреванием при 95 ° C в течение 5 минут (A, B) или 6 минут (C, D) и тестировалось либо на Bio-Rad CFX96, либо на Axxin T8. Предел обнаружения с вероятностью 95% был определен с помощью пробит-анализа и составил: (A) 20 копий на реакцию на Bio-Rad CFX96 и (B) 23 копии на реакцию на Axxin T8 для образцов из носоглотки. Установлено, что предел обнаружения в слюне составляет: (C) 93 копии на реакцию на Bio-Rad CFX96 и (D) 116 копий на реакцию на Axxin T8.

Рис. 4. Блок-схема тестирования и анализа по…

Рис. 4. Блок-схема тестирования и анализа по типу образца.

Блок-схема показывает количество участников…

Рис. 4. Блок-схема тестирования и анализа по типу образца.

Блок-схема показывает количество участников, у которых было подтверждено наличие инфекции SARS-CoV-2, и соответствующее количество образцов по типам, которые были собраны и проанализированы с помощью RT-qPCR и RT-LAMP.

Рис. 5. Распределение Ct по типу образца.

Рис. 5. Распределение Ct по типу образца.

Частотное распределение значений Ct, полученных с помощью…

Рис. 5. Распределение Ct по типу образца.

Частотное распределение значений Ct, полученных с помощью RT-qPCR для (A) мазков из носоглотки, (B) мазков из носа и (C) образцов слюны пациентов, которые предоставили все три типа образцов (n = 41). Значения Ct соответствующих образцов носоглотки, носа и слюны от одних и тех же пациентов нанесены на график и стратифицированы по (D) мазку из носа Ct35 и (G) отрицательному мазку из носа.

Рис. 6. Работа RT-LAMP на клинических образцах.

Рис. 6. Работа RT-LAMP на клинических образцах.

(A,B) Сводка результатов RT-LAMP для образцов из носоглотки,…

Рис. 6. Характеристики RT-LAMP на клинических образцах.

(A,B) Сводка результатов RT-LAMP для образцов из носоглотки, стратифицированных по значению Ct, полученному в RT-qPCR. Образцы носоглотки тестировали на (A) приборе Bio-Rad CFX9.6 и (B) Axxin T8. (C) Положительное согласие и 95% доверительные интервалы с RT-qPCR при различных порогах Ct. (D, E) Сводка результатов RT-LAMP для назальных образцов по сравнению со значением Ct назального образца, полученным в RT-qPCR, при тестировании на (D) Bio-Rad CFX96 и (E) Axxin T8. (F) Положительное и отрицательное согласие с RT-qPCR и 95% доверительные интервалы для назальных образцов. (G, H) Сводка результатов RT-LAMP для образцов слюны по сравнению со значением Ct образца слюны, полученным в RT-qPCR, при тестировании на (G) Bio-Rad CFX96 и (H) Axxin T8. (I) Положительное и отрицательное совпадение с RT-qPCR и 95% доверительные интервалы для образцов слюны.

Рис. 7. Назальное распределение Ct в наблюдениях…

Рис. 7. Распределение назального Ct в популяции наблюдения и популяции госпитализированных пациентов.

(A) Среднее, стандарт…

Рис. 7. Распределение назального Ct в популяции наблюдения и популяции госпитализированных пациентов.

(A) Среднее значение, стандартное отклонение и диапазон значений Ct и (B) частотные распределения значений Ct для подтверждающих назальных тестов RT-qPCR после того, как человек дал положительный результат на LAMP (n = 8), для лиц, которые дали положительный результат как часть программы эпиднадзора Университета Райса с поставщиком тестирования, который проводил подтверждающие тесты RT-qPCR (n = 136), и для всех госпитализированных пациентов с положительным результатом назальной RT-qPCR (n = 35).

См. это изображение и информацию об авторских правах в PMC

Похожие статьи

• Эффективность и экономическая эффективность четырех различных стратегий эпиднадзора за SARS-CoV-2 среди населения в целом (исследование CoV-Surv): структурированное резюме протокола исследования для кластерно-рандомизированного двухфакторного контролируемого исследования.

  Декерт А., Андерс С., де Аллегри М., Нгуен Х.Т., Суарес А., МакМахон С., Бернер К., Мерер М., Хербст К., Санд М., Кеппель Л., Симс Т., Бругнара Л., Бреннер С., Берк Р., Лу Д. , Киррмайер Д., Дуан Ю., Овчинникова С., Маркс М., Крауслих Х.Г., Кноп М., Бернигхаузен Т., Денкингер К. Декерт А. и др. Испытания. 2021 8 января; 22(1):39. doi: 10.1186/s13063-020-04982-z. Испытания. 2021. PMID: 33419461 Бесплатная статья ЧВК.

• Быстрое и безэкстракционное обнаружение SARS-CoV-2 из слюны с помощью колориметрической изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции.

  Лалли М.А., Лангмаде Дж.С., Чен Х, Фроник К.С., Сойер К.С., Бурча Л.С., Уилкинсон М.Н., Фултон Р.С., Хайнц М., Бухсер В.Дж., Хед Р.Д., Митра Р.Д., Милбрандт Дж. Лалли М.А. и соавт. Клин Хим. 2021 30 января; 67 (2): 415-424. дои: 10.1093/клинхем/hvaa267. Клин Хим. 2021. PMID: 33098427 Бесплатная статья ЧВК.

• Доступный экспресс-тест с поддержкой LAMP (ALERT) для обнаружения SARS-CoV-2.

  Бекташ А., Ковингтон М.Ф., Айдельберг Г., Арсе А., Матуте Т., Нуньес И., Уолш Дж., Бутбул Д., Делогерр С., Линднер А.Б., Федеричи Ф., Джаяпракаш А.Д. Бекташ А. и др. Вирусы. 2021 23 апреля; 13 (5): 742. дои: 10.3390/v13050742. Вирусы. 2021. PMID: 33922716 Бесплатная статья ЧВК.

• Обнаружение SARS-CoV-2 с помощью флуоресцентной петлевой изотермической амплификации с выделением РНК и без него.

  Таки К., Ёкота И., Фукумото Т., Ивасаки С., Фудзисава С., Такахаши М., Негиши С., Хаясака К., Сато К., Огури С., Нисида М., Сугита Дж., Конно С., Сайто Т., Тешима Т. Таки К. и др. J заразить Chemother. 2021 фев; 27 (2): 410-412. doi: 10.1016/j.jiac.2020.10.029. Epub 2020 31 октября. J заразить Chemother. 2021. PMID: 33214073 Бесплатная статья ЧВК.

• Стратегии, облегчающие тесты на амплификацию нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 без экстракции.

  Дельгадо-Диас Д.Дж., Сактхивел Д., Нгуен Х.Т., Фаррокжад К., Хоппер В., Нарх К.А., Ричардс Дж.С. Дельгадо-Диас Д.Дж. и др. Вирусы. 2022 15 июня; 14 (6): 1311. дои: 10.3390/v14061311. Вирусы. 2022. PMID: 35746782 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

Посмотреть все похожие статьи

Цитируется

• Обнаружение SARS-CoV-2 с использованием амплификации, зависящей от геликазы обратной транскрипции, и амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции, в сочетании с анализом латерального потока.

  Засада А.А., Мосей Э., Прыгель М., Полак М., Вдовяк К., Форминьска К., Жулковский Р., Жуковский К., Мархлевич К., Новинский А., Новинская Й., Расставицкий В., Малиновская Е. Засада А.А. и соавт. Биомедицины. 2022 сен 19;10(9):2329. doi: 10.3390/биомедицины10092329. Биомедицины. 2022. PMID: 36140431 Бесплатная статья ЧВК.

• Разработка и внедрение простого и быстрого рабочего процесса без извлечения слюны SARS-CoV-2 RT-LAMP для наблюдения на рабочем месте.

  Li Z, Bruce JL, Cohen B, Cunningham CV, Jack WE, Kunin K, Langhorst BW, Miller J, Moncion RA, Poole CB, Premsrirut PK, Ren G, Roberts RJ, Tanner NA, Zhang Y, Carlow CKS. Ли Зи и др. ПЛОС Один. 2022 26 мая; 17 (5): e0268692. doi: 10.1371/journal.pone.0268692. Электронная коллекция 2022. ПЛОС Один. 2022. PMID: 35617204 Бесплатная статья ЧВК.

• Новые клинически проверенные методы обнаружения COVID-19.

  Castellanos M, Somoza Á. Кастелланос М. и др. FEBS J. 2022, 1 мая: 10.1111/февраль 16469. дои: 10.1111/февраль 16469. Онлайн перед печатью. ФЕБС Дж. 2022. PMID: 354

  Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

• Улучшение обнаружения РНК SARS-CoV-2 с помощью RT-LAMP за счет выбора и комбинации набора праймеров.

  Чжан Ю, Таннер Н.А. Чжан И и др. ПЛОС Один. 1 апреля 2022 г .; 17 (4): e0254324. doi: 10.1371/journal.pone.0254324. Электронная коллекция 2022. ПЛОС Один. 2022. PMID: 35363770 Бесплатная статья ЧВК.

использованная литература

1. 1. Ларремор Д.Б., Уайлдер Б., Лестер Э., Шехата С., Берк Дж.М., Хэй Дж.А. и др. Чувствительность теста вторична по отношению к частоте и времени выполнения скрининга на COVID-19. Научная реклама 2021;7. doi: 10.1126/sciadv.abd5393 — DOI — ЧВК — пабмед
2. 1. Chin ET, Huynh BQ, Chapman LAC, Murrill M, Basu S, Lo NC. Частота планового тестирования на коронавирусную болезнь 2019 г. (COVID-19) в медицинских учреждениях с высоким риском для сокращения вспышек. Клин Инфекция Дис. 2021; 73: e3127–e3129. дои: 10.1093/cid/ciaa1383 — DOI — ЧВК — пабмед
3. 1. Палтиэль А. Д., Чжэн А., Валенский Р.П. Оценка стратегий скрининга SARS-CoV-2 для обеспечения безопасного повторного открытия кампусов колледжей в Соединенных Штатах. JAMA Сеть открыта. 2020;3: e2016818. doi: 10.1001/jamanetworkopen.2020.16818 — DOI — ЧВК — пабмед
4. 1. Пратер К.А., Ван К.С., Шули Р.Т. Снижение передачи SARS-CoV-2. Наука. 2020; 368: 1422–1424. doi: 10.1126/science.abc6197 — DOI — пабмед
5. 1. Гоял А. , Ривз Д.Б., Кардозо-Охеда Э.Ф., Шиффер Дж.Т., Майер Б.Т. Вирусная нагрузка и неоднородность контактов позволяют прогнозировать передачу SARS-CoV-2 и события сверхраспространения. Элиф. 2021;10: e63537. дои: 10.7554/eLife.63537 — DOI — ЧВК — пабмед

Типы публикаций

термины MeSH

вещества

Дополнительные понятия

Грантовая поддержка

Финансирование этой работы было предоставлено американским народом USAID через исследовательский грант IAVI CCID 9204 в соответствии с решением AID-OAA-A16-00032 между IAVI и USAID, а также за счет внутреннего финансирования Университета Райса. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Полнотекстовые ссылки

Публичная научная библиотека Бесплатная статья ЧВК

Укажите

Формат: ААД АПА МДА НЛМ

Отправить на

Молекулярный тест на основе RT-LAMP для быстрого, чувствительного и недорогого колориметрического обнаружения SARS-CoV-2 в клинических образцах

. 2021 12 августа; 11 (1): 16430.

doi: 10.1038/s41598-021-95799-6.

Катарина Амарал ¹ , Уилсон Антунес ² , Элин Мо ¹ , Америко Г Дуарте ¹ , Луис М. П. Лима ¹ , Кристиана Сантос ¹ , Инес Л Гомес ² , Гонсалу С. Афонсу ¹ , Рикардо Виейра ² , Хелена София С Телес ³ , Мариса С Рейс ³ , Мануэль Рамальо да Силва ⁴ , Ана Маргарида Энрикес ⁵ , Мигель Феверейро ⁵ , М Рита Вентура ¹ , Моника Серрано ⁶ , Катарина Пиментель ⁷

Принадлежности

• ¹ Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa, Av. República, 2780-157, Оэйраш, Португалия.
• ² Centro de Investigação da Academia Militar (CINAMIL), Объединенная военная лаборатория биологической и химической защиты (UMLDBQ), Av. Доктор Альфредо Бенсауде, 1849-012, Лиссабон, Португалия.
• ³ Centro de Medicina Naval-Marinha Portuguesa, Alfeite, 2810-001, Алмада, Португалия.
• ⁴ Hospital das Forças Armadas, Azinhaga dos Ulmeiros, 1649-020, Лиссабон, Португалия.
• ⁵ Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária, IP, Laboratorio de Virologia, Av. República, Quinta do Marquês, 2780-157, Oeiras, Португалия.
• ⁶ Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa, Av. República, 2780-157, Оэйраш, Португалия. серрано@itqb.unl.pt.
• ⁷ Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa, Av. República, 2780-157, Оэйраш, Португалия. [email protected].

• PMID: 34385527
• PMCID: PMC8361189
• DOI: 10.1038/с41598-021-95799-6

Бесплатная статья ЧВК

Катарина Амарал и др. Научный представитель 2021 .

Бесплатная статья ЧВК

. 2021 12 августа; 11 (1): 16430.

doi: 10.1038/s41598-021-95799-6.

Авторы

Катарина Амарал ¹ , Уилсон Антунес ² , Элин Моэ ¹ , Америко Г Дуарте ¹ , Луис М. П. Лима ¹ , Кристиана Сантос ¹ , Инес Л Гомес ² , Гонсалу С. Афонсу ¹ , Рикардо Виейра ² , Хелена София С Телес ³ , Мариса С. Рейс ³ , Мануэль Рамальо да Силва ⁴ , Ана Маргарида Энрикес ⁵ , Мигель Феверейро ⁵ , М Рита Вентура ¹ , Моника Серрано ⁶ , Катарина Пиментель ⁷

Принадлежности

• ¹ Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa, Av. República, 2780-157, Оэйраш, Португалия.
• ² Centro de Investigação da Academia Militar (CINAMIL), Объединенная военная лаборатория биологической и химической защиты (UMLDBQ), Av. Доктор Альфредо Бенсауде, 1849 г.-012, Лиссабон, Португалия.
• ³ Centro de Medicina Naval-Marinha Portuguesa, Alfeite, 2810-001, Алмада, Португалия.
• ⁴ Hospital das Forças Armadas, Azinhaga dos Ulmeiros, 1649-020, Лиссабон, Португалия.
• ⁵ Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária, IP, Laboratorio de Virologia, Av. República, Quinta do Marquês, 2780-157, Oeiras, Португалия.
• ⁶ Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa, Av. República, 2780-157, Оэйраш, Португалия. серрано@itqb.unl.pt.
• ⁷ Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa, Av. República, 2780-157, Оэйраш, Португалия. [email protected].

• PMID: 34385527
• PMCID: PMC8361189
• DOI: 10.1038/с41598-021-95799-6

Абстрактный

До тех пор, пока не будет реализована эффективная программа вакцинации против COVID-19, надежная стратегия тестирования наряду с профилактическими мерами будет по-прежнему оставаться наиболее эффективным способом контроля распространения болезни. Такая стратегия должна опираться на разрозненные диагностические тесты, чтобы предотвратить замедление темпов тестирования из-за нехватки материалов и реагентов из-за проблем с цепочкой поставок, которые произошли в начале пандемии. В этом исследовании мы разработали однопробирочный тест на основе RT-LAMP, который позволяет визуально обнаруживать менее 100 копий вирусного генома SARS-CoV-2 в течение 30 минут. Мы сравнили анализ с золотым стандартом теста на COVID-19.диагностика, ОТ-ПЦР, с использованием 177 образцов носоглоточной РНК. Для вирусной нагрузки выше 100 копий анализ RT-LAMP имел чувствительность 100% и специфичность 96,1%. Кроме того, мы разработали тест RT-LAMP без экстракции РНК, способный обнаруживать SARS-CoV-2 непосредственно в образцах слюны, хотя и с более низкой чувствительностью. Слюну собирали самостоятельно, а пробирка для сбора оставалась закрытой до инактивации, что обеспечивало защиту тестирующего персонала. Как и ожидалось, выделение РНК из образцов слюны повысило чувствительность теста. Чтобы снизить затраты, связанные с экстракцией РНК, мы выполнили этот шаг, используя альтернативный протокол, в котором используются колонки для экстракции плазмидной ДНК. Мы также произвели ферменты, необходимые для анализа, и внедрили тест RT-LAMP собственного производства, не зависящий от конкретных каналов сбыта. Наконец, мы разработали новый колориметрический метод, который позволял обнаруживать продукты LAMP путем визуализации явного изменения цвета, независимо от рН реакции.

© 2021. Автор(ы).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Цифры

Рисунок 1

Предел обнаружения…

Рисунок 1

Предел обнаружения двух разных форматов RT-LAMP и RT-PCR. (…

фигура 1

Предел обнаружения двух разных форматов RT-LAMP и RT-PCR. ( A ) Известное количество копий транскрибированной in vitro (IVT) вирусной РНК (N-ген) было амплифицировано и обнаружено с помощью колориметрической RT-LAMP с использованием (i) колориметрической LAMP WarmStart 2 × Master Mix (New England Biolabs) или (ii) отдельные компоненты (ферменты, приобретаемые отдельно, и колориметрический буфер собственного производства). Реакции инкубировали при 65°С в течение 30 мин. ( B ) 10 мкл реакции RT-LAMP разделяли электрофорезом в агарозном геле (2%). Шаблон лестницы соответствует ожидаемому шаблону усиления LAMP. ( C ) Предел обнаружения десяти повторов двух тестовых форматов. ( D ) Стандартная кривая, построенная путем нанесения количества копий РНК IVT (ось x) в зависимости от среднего значения соответствующего порогового цикла RT-PCR (Ct) (ось y) трех независимых экспериментов (Исходные изображения геля на рис. S1).

Рисунок 2

Обнаружение SARS-CoV-2 в NP…

Рисунок 2

Обнаружение SARS-CoV-2 в образцах NP с использованием RT-LAMP. ( A ) Сравнение…

фигура 2

Обнаружение SARS-CoV-2 в образцах NP с использованием RT-LAMP. ( A ) Сравнение результатов RT-LAMP и RT-PCR. Значения Ct (результаты ОТ-ПЦР) 126 пациентов с COVID-19положительных пациентов (ось Y) сравнивали с показаниями RT-LAMP (ось X), полученными после 30 минут инкубации при 65 °C (положительные, +/желтый; отрицательные, -/розовый). Пунктирная красная линия указывает Ct ниже, что соответствует 100% совпадению между RT-LAMP и RT-PCR. ( B ) Чувствительность анализа RT-LAMP в разных диапазонах значений Ct (которые отражают разные вирусные нагрузки). Более толстые горизонтальные линии показывают специфичность, рассчитанную для указанного диапазона Ct (по данным панели ( A ) и Таблицу 1). Вертикальные линии указывают соответствующие 95% доверительные интервалы.

Рисунок 3

Предел обнаружения…

Рисунок 3

Предел обнаружения анализа слюны RT-LAMP. Эксперименты со здоровым…

Рисунок 3

Предел обнаружения анализа слюны RT-LAMP. Эксперименты по добавлению слюны здорового донора ( A ) десятикратными разведениями транскрибированной in vitro (IVT) вирусной РНК (N-ген) и ( B ) размноженных in vitro вирионов SARS-CoV-2. Образцы слюны обрабатывали, как описано в разделе «Материалы и методы», и 2 мкл анализировали с помощью колориметрической RT-LAMP. БОЕ бляшкообразующих единиц. Цифры являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.

Рисунок 4

Обнаружение SARS-CoV-2 в слюне…

Рисунок 4

Обнаружение SARS-CoV-2 в образцах слюны с помощью RT-LAMP. RT-LAMP анализ образцов слюны…

Рисунок 4

Обнаружение SARS-CoV-2 в образцах слюны с помощью RT-LAMP. RT-LAMP анализ образцов слюны пациентов с подтвержденным COVID-19, которые ( A ) индуцированное или неиндуцированное ( B ) слюноотделение перед сбором образца. ( C ) Сравнение результатов RT-LAMP и RT-PCR. Значения Ct (результаты ОТ-ПЦР) 39 пациентов с положительным результатом на COVID-19 (ось Y) сравнивали с показаниями RT-LAMP соответствующих образцов слюны (ось X) после 30 минут инкубации при 65 °C ( положительный, +/желтый, отрицательный, -/розовый). Черные круги — прямая слюна; оранжевые кружки — РНК, выделенная из слюны. ( D ) РНК из слюны ложноотрицательных образцов (как определено прямым тестом слюны) экстрагировали с использованием колонок с плазмидной ДНК miniprep (ZR Plasmid Miniprep-Classic Kit, Zymo Research) и повторно анализировали. NTC нет контроля шаблона. Указаны Cts (ген N), полученные для парных образцов NP.

Рисунок 5

Аналитическая чувствительность собственного производства…

Рисунок 5

Аналитическая чувствительность собственного колориметрического анализа RT-LAMP. Десятикратные разведения in vitro…

Рисунок 5

Аналитическая чувствительность собственного колориметрического анализа RT-LAMP. Десятикратные разведения транскрибированной in vitro (IVT) вирусной РНК (N-ген) амплифицировали с помощью RT-LAMP и определяли с использованием колориметрического буфера вместе с ( A ) RTx (New England Biolabs) и Bst LF (домашнего изготовления), ( B ) MashUP RT (самодельные) и Bst 2. 0 (New England Biolabs) или ( C ) MashUP RT (самодельные) и Bst LF (самодельные). Затем установка собственного производства была использована для обнаружения последовательностей SARS-CoV-2 в ( D ) РНК, выделенные из образцов жидкости NP (NPF) и ( E ) слюны пациентов с положительным результатом на COVID-19. Реакции инкубировали при 65°С в течение 30 мин. В ( D ) и ( E ) указаны Cts (ген N), полученные для парных образцов NP. NTC без контрольной матрицы, HD здоровый донор. Цифры являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.

Рисунок 6

Альтернативное колориметрическое определение на основе…

Рисунок 6

Альтернативное колориметрическое определение на основе комплекса мурексид-цинк. ( A ) Сильный…

Рисунок 6

Альтернативное колориметрическое определение на основе комплекса мурексид-цинк. ( A ) При добавлении пирофосфата (PPi) к раствору, содержащему Zn-MX, наблюдается сильное изменение цвета с желтого на розовый. Десятикратные разведения транскрибированной in vitro (IVT) вирусной IVT РНК (Ngene) амплифицировали с помощью RT-LAMP и определяли с помощью фенолового красного ( B ) или Zn-MX ( C ). Амплификацию подтверждали электрофорезом в агарозном геле (AGE). Образцы слюны здорового донора (HD) и девяти пациентов с COVID-19 были проанализированы с помощью RT-LAMP с последующим обнаружением с помощью Zn-MX ( D ) или фенолового красного ( E ), а амплификация была подтверждена AGE (Original изображения геля на рис. S1).

См. это изображение и информацию об авторских правах в PMC

Похожие статьи

• Быстрое и безэкстракционное обнаружение SARS-CoV-2 из слюны с помощью колориметрической изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции.

  Лалли М.А., Лангмаде Дж.С., Чен Х, Фроник К.С., Сойер К.С., Бурча Л.С., Уилкинсон М.Н., Фултон Р.С., Хайнц М., Бухсер В.Дж., Хед Р.Д., Митра Р.Д., Милбрандт Дж. Лалли М.А. и соавт. Клин Хим. 2021 30 января; 67 (2): 415-424. doi: 10.1093/clinchem/hvaa267. Клин Хим. 2021. PMID: 33098427 Бесплатная статья ЧВК.

• Колориметрическая изотермическая амплификация, опосредованная петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), как визуальная диагностическая платформа для обнаружения нового коронавируса SARS-CoV-2.

  Наваттанапаибун К , Пасомсуб Э , Промбун П , Вонгбунмак А , Дженджитванич А , Махасупачай П , Ветчо П , Чайрач С , Манатджароенлап Н , Сампхаонгерн С , Ваттаначокчай Т , Лидоркмай П , Манопвизеджароен С , Аккаравонгсапат Р , Пханонч Атитан , Тити Панбангред В , Чауватчарин С , Шрихирин Т . Наваттанапайбун К. и др. Аналитик. 2021 21 января; 146 (2): 471-477. дои: 10.1039/d0an01775b. Epub 2020 9 ноября. Аналитик. 2021. PMID: 33165486

• Новый колориметрический анализ RT-LAMP на основе RdRp для быстрого и чувствительного обнаружения SARS-CoV-2 в клинических пробах и пробах сточных вод из Пакистана.

  Хак МФУ, Бухари С.С., Эджаз Р., Заман Ф.У., Шриджит К.Р., Рашид Н., Умер М., Шахзад Н. Haque MFU и др. Вирус рез. 2021 Сентябрь;302:198484. doi: 10.1016/j.virusres.2021.198484. Epub 2021 17 июня. Вирус рез. 2021. PMID: 34146608 Бесплатная статья ЧВК.

• Недавнее обновление передовых методов молекулярной диагностики пандемии COVID-19: обзор.

  Робертс А., Чоухан Р.С., Шахдео Д., Шрикришна Н.С., Кесарвани В., Хорват М., Ганди С. Робертс А. и др. Фронт Иммунол. 2021 14 декабря; 12:732756. doi: 10.3389/fimmu.2021.732756. Электронная коллекция 2021. Фронт Иммунол. 2021. PMID: 34970254 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

• Инструменты на основе CRISPR: альтернативные методы диагностики COVID-19.

  Palaz F, Kalkan AK, Tozluyurt A, Ozsoz M. Палац Ф. и др. Клин Биохим. 2021 март;89:1-13. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2020.12.011. Epub 2021 9 января. Клин Биохим. 2021. PMID: 33428900 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

Посмотреть все похожие статьи

Цитируется

• Разработка и валидация изотермической амплификации, опосредованной обратной транскриптазной петлей (RT-LAMP), в качестве простого и быстрого диагностического инструмента для обнаружения SARS-CoV-2.

  Альдоссари А.М., Тауфик Э.А., Алтаммами М.А., Алквейт А.А., Бук Р.Ю., Сенди Б.К., Аларави М.С., Гожобори Т., Алтамими А.М., Алайфан Т.А., Альбарраг А.М., Альямани Э.Дж. Альдоссари А.М. и соавт. Диагностика (Базель). 2022 15 сентября; 12 (9): 2232. дои: 10.3390/diagnostics12092232. Диагностика (Базель). 2022. PMID: 36140632 Бесплатная статья ЧВК.

• Улучшенное визуальное обнаружение амплификации ДНК с использованием пиридилазофенольных красителей, чувствительных к металлам.

  Чжан Ю., Хант Э.А., Таманаха Э., Корреа И.Р. мл., Таннер Н.А. Чжан И и др. коммун биол. 2022 сен 21; 5 (1): 999. doi: 10.1038/s42003-022-03973-x. коммун биол. 2022. PMID: 36130997 Бесплатная статья ЧВК.

• Колориметрический и флуорометрический анализ изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), для диагностики SARS-CoV-2.

  Алхамид Г., Томбулоглу Х., Мотабагани Д., Мотабагани Д., Рабаан А.А., Унвер К., Дорадо Г., Аль-Сухайми Э., Унвер Т. Алхамид Г. и др. Функц Интегр Геномикс. 2022 сен 12:1-11. doi: 10.1007/s10142-022-00900-5. Онлайн перед печатью. Функц Интегр Геномикс. 2022. PMID: 36089609 Бесплатная статья ЧВК.

• Клинические испытания образцов мазков SARS-CoV-2 с использованием изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции (RT-LAMP).

  Лай М.Ю., Бухари Ф.Д.М., Зулкефли Н.З., Исмаил И., Мустапа Н.И., Сох Т.Т. Лай М.И. и соавт. BMC Infect Dis. 2022 18 августа; 22 (1): 697. doi: 10.1186/s12879-022-07684-w. BMC Infect Dis. 2022. PMID: 35982419 Бесплатная статья ЧВК.

• Два года пандемии COVID-19: извлеченные уроки.

  da Silva SJR, do Nascimento JCF, Germano Mendes RP, Guarines KM, Targino Alves da Silva C, da Silva PG, de Magalhães JJF, Vigar JRJ, Silva-Junior A, Kohl A, Pardee K, Pena L. да Силва С.Дж.Р. и др. ACS Infect Dis. 2022 9 сентября; 8 (9): 1758-1814. doi: 10.1021/acsinfecdis.2c00204. Epub 2022 8 августа. ACS Infect Dis. 2022. PMID: 35940589 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.

Просмотреть все статьи «Цитируется по»

использованная литература

1. 1. Нагамин К., Хасэ Т., Нотоми Т. Ускоренная реакция с помощью изотермической амплификации, опосредованной петлей, с использованием петлевых праймеров. Мол. Клеточные зонды. 2002; 16: 223–229. doi: 10.1006/mcpr.2002.0415. — DOI — пабмед
2. 1. Нотоми Т. и др. Петлевая изотермическая амплификация ДНК. Нуклеиновые Кислоты Res. 2000;28:E63. doi: 10.1093/нар/28.12.e63. — DOI — ЧВК — пабмед
3. 1. Томита Н., Мори Ю., Канда Х., Нотоми Т. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) последовательностей генов и простое визуальное обнаружение продуктов. Нац. протокол 2008; 3: 877–882. doi: 10.1038/nprot.2008.57. — DOI — пабмед
4. 1. Ан С. Дж. и соавт. Быстрое и простое колориметрическое обнаружение множественных вирусов гриппа, заражающих людей, с использованием диагностической платформы изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции (RT-LAMP). Заражение BMC. Дис. 2019;19:676. doi: 10.1186/s12879-019-4277-8. — DOI — ЧВК — пабмед
5. 1. Бхадра С. и др. Анализы изотермической амплификации с подтвержденной последовательностью в режиме реального времени для выявления коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ) PLoS One. 2015;10:e0123126. doi: 10.1371/journal.pone.0123126. — DOI — ЧВК — пабмед

Типы публикаций

термины MeSH

вещества

Дополнительные понятия

Клинические испытания образцов мазков SARS-CoV-2 с использованием изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции (RT-LAMP) | BMC Инфекционные заболевания

• Исследования
• Открытый доступ
• Опубликовано: 18 августа 2022 г.

• Meng Yee Lai ¹ ,
• Fatma Diyana Mohd Bukhari ¹ ,
• Nur Zulaikha Zulkefli ¹ ,
• Ilyiana Ismail ² ,
• Nur Izati Mustapa ² ,
• Tuan Suhaila Туан Со ² ,
• Afifah Haji Hassan ² ,
• Kalaiarasu M. Peariasamy ³ ,
• Yee Leng Lee ⁴ ,
• Jeyanthi Suppiah ⁵ ,
• Ravindran Thayan ⁵ ,
• Мохд Хайри Мат Иса ⁶ ,
• Нур Зафира Абдул Вахид ⁶ и
• …
• Йи Линг Лау ¹  

BMC Инфекционные заболевания том 22 , Номер статьи: 697 (2022) Процитировать эту статью

• 422 доступа

• 1 Альтметрический

• Детали показателей

Abstract

Background

Высокая стоимость коммерческих наборов для выделения РНК ограничивает эффективность тестирования SARS-CoV-2. Здесь мы разработали простой метод выделения нуклеиновых кислот для обнаружения SARS-CoV-2 непосредственно из образцов мазков из носоглотки.

Методы

В качестве метода определения конечной точки использовали краситель, чувствительный к рН. Очевидные изменения цвета между положительными и отрицательными реакциями устраняют необходимость в другом оборудовании.

Результаты

Клинические испытания с использованием 260 образцов показали 92,7% чувствительность (95% ДИ 87,3–96,3%) и 93,6% специфичность (95% ДИ 87,3–97,4%) RT-LAMP.

Выводы

Простой метод выделения РНК сводит к минимуму потребность в каком-либо сложном лабораторном оборудовании. Мы предлагаем объединить этот простой метод выделения нуклеиновых кислот и технологию RT-LAMP в качестве диагностического инструмента по месту оказания медицинской помощи.

Отчеты экспертной оценки

Введение

Коронавирусная болезнь 2019 (COVID-19), вызванная самым недавно открытым коронавирусом, тяжелым острым респираторным синдромом коронавирус 2 (SARS-CoV-2) поразила весь мир с декабря 2019 года. Массовое тестирование и выявление инфицированных лиц имеют первостепенное значение в условиях продолжающейся пандемии COVID-19. Для борьбы с этой пандемией необходима простая и быстрая лабораторная диагностика. Это исследование направлено на упрощение текущего метода, используемого для диагностики COVID-19, а также на предложение лучших методов сбора образцов и извлечения РНК. В настоящее время метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR) остается золотым стандартом и наиболее надежным методом обнаружения вируса. Однако метод детекции на основе ПЦР трудоемок, дорог и требует много времени, так как требует специальных приборов, реагентов в ограниченном количестве и хорошо обученного персонала [1, 2]. Альтернативой RT-qPCR является изотермическая амплификация, опосредованная петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), анализ, который может обнаружить нуклеиновую кислоту за короткое время с использованием 4–6 специально разработанных праймеров, которые гибридизуются с 6–8 областями целевого гена. что приводит к высокой специфичности [3]. Колориметрический анализ RT-LAMP позволяет быстро и легко интерпретировать результаты, для чего требуется только изотермический источник тепла [4]. Это делает его проще, дешевле и быстрее по сравнению с другими молекулярными методами [3, 5].

Здесь мы использовали модифицированный метод концентрации смолы Chelex 100 в сочетании с колориметрическим тестом RT-LAMP на образцах мазков из носоглотки в вирусной транспортной среде (VTM) путем амплификации гена N , который кодирует нуклеокапсидную область SARS-CoV-2. РНК экстрагировали с использованием хелатирующей смолы без дополнительной стадии очистки. Экстрагированная РНК служила матрицей для анализа RT-LAMP. В качестве индикатора цвета использовали рН-чувствительный колориметрический краситель феноловый красный [6]. Положительная амплификация целевой последовательности приводила к изменению цвета с розового на желтый.

Методы

Источники образцов

Больница Сунгай Булох (HSB) и Институт медицинских исследований (IMR), Малайзия предоставили в общей сложности 260 свежих образцов мазков из носоглотки в 250 мкл VTM (дополнительный файл 1: таблица S1). Перед этим образцы мазков инактивировали нагреванием при 65 °C в течение 1 часа. Из 260 образцов 150 образцов были подтверждены положительными на SARS-CoV-2 (HSB, n = 60 и IMR, n = 90) с помощью RT-qPCR со значением Ct в диапазоне от 12,71 до 38,80, в то время как 110 образцов были признаны отрицательными (HSB, n = 50 и IMR, n = 60). Набор для выделения РНК и набор для RT-qPCR, использованные в этом исследовании, представляли собой QIAamp Viral RNA Mini Kit (Hilden, Германия) и SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) соответственно. Это исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике УГМК (202041-8418) и Комитетом по этике медицинских исследований Министерства здравоохранения Малайзии (MREC) (NMRR-20-2344-569).94).

Препарат РНК

Экстракцию РНК проводили с использованием протокола экстракции смолы Chelex 100, принятого у Janíková et al. и Перес и др. с небольшими изменениями [7, 8]. Смолу Chelex 100 (Biorad Laboratories, США) взвешивали и разбавляли 1× TE Buffer (pH 8) (Promega Corp. , США) в концентрации 30%. 30% (масса/объем) Chelex-TE энергично встряхивали в течение 10 с и хранили при 4 °C для надлежащего хранения. В стерильных условиях 30 мкл образцов смешивали с 45 мкл 30% Chelex-TE путем трехкратного пипетирования вверх и вниз. Реакцию инкубировали в течение 98 °C в течение 2 минут, а затем еще 2 минутной инкубации на льду. После этого образец центрифугировали в течение 1 мин. Супернатант переносили в новую пробирку, а осадок отбрасывали. В супернатант добавляли ацетат натрия (NaAc) с pH 5,3 с конечной концентрацией 0,3 М. Затем в реакцию включали 3 объема ледяного этанола (225 мкл) и встряхивали в течение 5 с. Пробирку вращали в течение 5 мин, чтобы собрать осадок РНК на дне. Супернатант удаляли, а осадок сушили на воздухе в течение 5–10 мин. Осадок повторно суспендировали с использованием 10 мкл 1× TE буфера с последующим встряхиванием в течение 30 с. Суспензия служила матрицей в анализе RT-LAMP.

Анализ RT-LAMP

Экстрагированные РНК амплифицировали с использованием гена нуклеокапсида (N), ориентируясь на область N1. Программное обеспечение Primer-Explorer V4 (Eiken Chemical Co., Ltd., Токио, Япония) использовалось для разработки праймеров (таблица 1), о чем сообщалось ранее [9]. Анализ RT-LAMP проводили в общей сложности 12,5 мкл реакционной смеси, которая состояла из 3,8 мкл воды, не содержащей РНКазы, 1,25 мкл 10-кратного буфера низкой концентрации (pH 8,3), 0,75 мкл сульфата магния MgSO ₄ (100 мМ ), 0,175 мкл каждого dNTP (dATP, dCTP, dGTP и dTTP по 100 мМ каждый), 1,9мкл смеси праймеров (состоящей из 40 пмоль FIP и BIP каждого, 10 пмоль FLP и BLP каждого, 5 пмоль F3 и B3 каждого), 0,75 мкл Bacillus stearothermophilus ( Bst ) 2,0 ДНК-полимеразы WarmStart, 0,15 мкл WarmStart RTx обратная транскриптаза, 0,5 мкл ингибитора РНКазы (0,5 ЕД/мкл) (NEB, Ипсвич, США), 0,5 мкл гидрохлорида гуанидиния (GuHCl) (1 М), 0,2 мкл фенолового красного (10 мМ) и 2 мкл матрицы РНК. Реакцию инкубировали при 50°С в течение 10 мин, затем при 65°С в течение 1 ч и, наконец, инактивировали при 80°С в течение 2 мин. Этот анализ RT-LAMP проводили с использованием нагревательного блока (Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., Ханчжоу, Китай). Феноловый красный использовали для прямого визуального обнаружения конечного продукта. Процесс инкубации внимательно контролировали в течение каждых 10 минут (до 1 часа), чтобы идентифицировать изменения цвета. Желтый цвет указывает на положительный образец, тогда как отрицательные реакции останутся розовыми (рис. 1).

Таблица 1 Праймеры, использованные в этом исследовании

Полноразмерная таблица

Рис. 1

Визуализация RT-LAMP с изменением цвета фенолового красного с розового (отрицательный) на желтый (положительный). Трубка 1: положительная реакция; Пробирка 2: Отрицательная реакция

Изображение в натуральную величину

Аналитическая чувствительность и специфичность

Для проверки аналитической чувствительности анализа RT-LAMP с феноловым красным была сконструирована рекомбинантная плазмида, несущая ген N . Праймеры F3 и B3 использовали для амплификации гена N из синтетического фрагмента (Sangon Biotec Co., Ltd., Шанхай, Китай). Условия ПЦР были следующими: денатурация при 94°С в течение 3 мин, 30 циклов при 94°С в течение 30 с, при 55°С в течение 30 с, при 72°С в течение 30 мин и заключительная стадия удлинения при 72°С. С в течение 10 мин. Затем продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле. Амплифицированный фрагмент гена очищали перед клонированием в вектор pGEM-T (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин) и трансформировали в TOP10F’ Escherichia coli 9.0757 компетентных клеток. Рекомбинантные плазмиды экстрагировали с помощью набора Qiagen Spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Germany) и отправляли в Apical Scientific SDN BHD (Куала-Лумпур, Малайзия) для секвенирования для подтверждения их идентичности. Вектор pGEM-T, содержащий вставку N , линеаризовали с помощью BamH I и транскрибировали в РНК с использованием систем производства крупной РНК RiboMAX™ (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин) в соответствии с инструкциями производителя. Число копий РНК рассчитывали по следующей формуле: копий/мкл = 6,02 × 10 ²³  × 10 ^–9  × концентрация (нг/мкл)/(длина фрагмента (п.н.) × 340) [10]. Затем готовили десятикратные серийные разведения транскрибированной РНК в диапазоне от 1 × 10 ⁶ копий/мкл до 1 копии/мкл.

Аналитический тест на специфичность проводили с использованием других респираторных вирусов, таких как аденовирус 4, коронавирус, грипп A h4, грипп B, новый грипп A h2N1, парагрипп 1, парагрипп 2, парагрипп 3, RSV (подтип A), RSV (подтип B ) (AMPLIRUN ^® Контроль РНК коронавируса (Vircell Microbiologist, Гранада, Испания).

Тест на клиническую чувствительность и специфичность

Клиническую чувствительность оценивали по формуле: (количество истинно положительных результатов)/(количество истинно положительных результатов + количество ложноотрицательных результатов), а специфичность рассчитывали как (количество истинно отрицательных результатов)/(количество истинно отрицательных результатов + количество ложных положительных результатов).

Результаты

Аналитический тест чувствительности гена N к феноловому красному RT-LAMP: 1 копия/мкл РНК. Ни один из других вирусов не был обнаружен с помощью анализа RT-LAMP. Используя здесь 260 образцов, были рассчитаны клиническая чувствительность и специфичность анализа RT-LAMP. Мы обнаружили, что большинство положительных образцов ОТ-ПЦР с Ct < 30 изменили цвет в течение первых 20 минут реакции. Образцы с Ct > 30 либо требовали больше времени для изменения цвета, либо вообще не меняли цвет. РТ-ЛАМПА показывает 9Чувствительность 2,7% (95% ДИ 87,3–96,3%) и специфичность 93,6% (95% ДИ 87,3–97,4%) соответственно.

Обсуждение

Высокая стоимость доступных в настоящее время коммерческих наборов для выделения РНК препятствует массовому тестированию Covid-19. Поэтому мы решили разработать новый метод выделения нуклеиновой кислоты для SARS-CoV-2 из образцов мазка из носоглотки. Без использования высокопроизводительного оборудования было извлечено в общей сложности 260 образцов, которые использовались в качестве матрицы для анализа RT-LAMP. Нам удалось достичь 9Чувствительность 2,7% и специфичность 93,6% для RT-LAMP. Этот метод извлечения прост в применении и может масштабироваться в зависимости от размера образца, что позволяет применять его как в клинических лабораториях, так и в полевых условиях. Наш недавно разработанный метод выделения РНК намного дешевле (2,27 доллара США за реакцию) по сравнению с коммерческим набором QIAamp Viral RNA Mini (6,45 долларов США за реакцию). С точки зрения скорости метод экстракции Chelex более быстрый (~ 16 мин.), чем обычный набор для экстракции (~ 40 мин.). Кроме того, коммерчески доступная смесь фенолового красного LAMP является дорогостоящей. Например, Теплый Старт ^® Colorimetric LAMP 2× Master Mix (New England Biolabs, США) стоит 3,65 долларов США за реакцию. При использовании пользовательского буфера make LAMP одна реакция стоит всего 1,95 доллара США за реакцию.

Из 260 протестированных образцов результаты показывают, что RT-LAMP не обнаружил 11 положительных результатов RT-PCR. Возможно, это произошло из-за того, что вирусная нагрузка образца была слишком низкой (RT-PCR Ct > 30) и произошла деградация во время доставки в наши лаборатории. Эти 11 образцов не были обнаружены с помощью RT-PCR и RT-LAMP после повторной экстракции с использованием коммерческого набора в наших лабораториях. Как упоминалось Azmi et al., диагностика SARS-CoV-2 особенно сложна на этапе выделения РНК, а образцы часто подвергаются риску деградации во время доставки [1]. С другой стороны, RT-LAMP обнаружил 7 отрицательных образцов RT-PCR. Эти образцы также были обнаружены положительными с помощью ОТ-ПЦР после экстракции Chelex. Это может быть связано с недостаточной уборкой рабочего пространства и дезинфекцией пипеток. Другой возможной причиной может быть перекрестное загрязнение образцов на этапе аликвотирования в клинических лабораториях.

По сравнению с нашим предыдущим исследованием [9], представленный здесь анализ RT-LAMP использовал феноловый красный в качестве индикатора, тогда как в предыдущем опубликованном анализе RT-LAMP в качестве индикатора использовался гидроксинафтоловый синий (HNB). Для положительной реакции добавление HNB в реакционную смесь вызовет изменение цвета с фиолетового на небесно-голубой. Поскольку изменение цвета между положительной и отрицательной реакцией было незначительным, мы решили использовать феноловый красный в качестве индикатора. Положительная реакция изменила цвет с розового на желтый, а отрицательная осталась розовой.

Методы экстракции Chelex на SARS-CoV-2 ранее были представлены несколькими группами исследователей. Однако с небольшими изменениями предыдущего метода, представленного Janíkova et al. и Perez et al., чувствительность разработанного здесь теста RT-LAMP (92,7%) была выше [7, 8]. Флинн и др. сообщили об анализе RT-LAMP с чувствительностью 90% с использованием протокола экстракции Chelex [11]. Яникова и др. удалось обнаружить SARS-CoV-2 до 12 копий/мкл, в то время как разработанный здесь анализ RT-LAMP успешно обнаружил РНК до 1 копии/мкл [7]. Между тем, Перес и соавт. тестировали образцы, извлеченные из Chelex, только с помощью ОТ-ПЦР, им удалось достичь 84,3% чувствительности ОТ-ПЦР [8].

Что касается Anathar et al., они сообщили о прямом анализе RT-LAMP с использованием образцов, которые были либо добавлены непосредственно в реакцию, либо инактивированы с помощью комбинированной стадии химической и термической обработки, либо инактивированы с последующей очисткой с помощью кремнезема на основе частиц. метод концентрации. Однако мы не смогли воспроизвести эти методы после нескольких испытаний. Неудача может быть связана с использованием различных типов ВТМ и наличием ингибиторов, таких как глюкоза, в ВТМ [12].

Мы обнаружили, что увеличение времени инкубации для образцов с Ct > 30 не помогает, поскольку может происходить неспецифическая амплификация. Этот вывод был аналогичен сообщению Dao Thi et al. [13]. Они обнаружили, что колориметрическое обнаружение SARS-CoV-2 с помощью RT-LAMP зависит от вирусной нагрузки, и показали, что положительные образцы с RT-PCR Ct < 30 изменили цвет в течение первых 30 минут реакции. Образцы с RT-PCR Ct > 30 либо потребовали больше времени для изменения цвета (> 35 мин), либо не изменили цвет.

Мы выбрали краситель pH-индикатор в качестве конечного метода обнаружения, поскольку феноловый красный является дешевым и нетоксичным для визуального обнаружения. Более того, изменения цвета между положительной и отрицательной реакцией очевидны, и изменение цвета можно увидеть невооруженным глазом. Четкие изменения цвета были бы полезны людям, работающим в области диагностики, чтобы точно интерпретировать результаты COVID-19 без дополнительной помощи и специального оборудования. Таким образом, феноловый красный приобрел популярность среди исследователей во всем мире при разработке диагностического инструмента для SARS-CoV-2 [4, 14, 15].

Поскольку феноловый красный чувствителен к изменениям pH, настоятельно рекомендуется готовить 10-кратный буфер низкой концентрации собственного производства небольшими аликвотами и хранить при температуре — 20 °C. Не рекомендуется замораживать-оттаивать буфер слишком много раз, чтобы избежать изменения рН. Кроме того, было предложено элюировать РНК буфером трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ТЕ) с рН 8 вместо дважды дистиллированной воды, поскольку дважды дистиллированная вода может поглощать углекислый газ из атмосферы, в результате чего рН воды становится слегка кислым. Из-за изменений pH буфера могут возникать ложные срабатывания.

Для повышения эффективности анализа RT-LAMP был добавлен GuHCl. В соответствии с рекомендацией Zhang et al., в реакционную смесь добавляли 40 мМ GuHCl [16]. Мы заметили, что время амплификации сократилось примерно на  5 мин по сравнению с образцами без GuHCl. В этом анализе RT-LAMP бетаин не добавляли. По сравнению с реакциями с бетаином мы обнаружили, что время амплификации для реакций без бетаина сократилось на ~ 15 мин. Аналогичные результаты были получены от Fu et al. и Гарсия-Берналт Диего и др. [17, 18]. Мы считаем, что наше исследование обеспечит новый путь для создания анализа RT-LAMP для быстрого обнаружения SARS-CoV-2, а также других вирусов.

С точки зрения стоимости/реакции анализ RT-LAMP в сочетании с методом выделения Chelex, представленный здесь, был намного дешевле, чем коммерческий набор RT-LAMP и набор для выделения РНК. Общая стоимость (метод экстракции Chelex и изготовленный на заказ буфер LAMP) составила 4,20 доллара США за реакцию. Между тем, общая стоимость имеющегося в продаже набора LAMP, такого как WarmStart ^® Colorimetric LAMP 2× Master Mix (New England Biolabs, США) и QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Германия), составляла 10,10 долларов США за реакцию.

Выводы

Здесь мы представляем простую процедуру выделения РНК из образцов мазка из носоглотки. Добавив краситель-индикатор pH и добавку в анализ RT-LAMP, нам удалось разработать быстрый, экономически эффективный и простой для интерпретации анализ для обнаружения SARS-CoV-2. Поэтому предполагается, что этот анализ RT-LAMP будет использоваться для массового скрининга в местных и специализированных лабораториях.

Наличие данных и материалов

Все соответствующие данные находятся в документе или дополнительном файле 1. Информация клонирована Ген доступен по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ON5

Ссылки

1. «>

   Azmi I, Faizan MI, Kumar R, Raj Yadav S, Chaudhary N, Kumar Singh D , и другие. Рабочий процесс без выделения РНК на основе слюны, интегрированный с Cas13a для обнаружения SARS-CoV-2. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:632646. https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.632646.

   КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

2. Lalli MA, Langmade JS, Chen X, Fronick CC, Sawyer CS, Burcea LC, et al. Быстрое обнаружение SARS-CoV-2 из слюны без экстракции с помощью колориметрической изотермической амплификации с обратной транскрипцией, опосредованной петлей. Клин Хим. 2020;67:415–24. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaa267.

   Артикул ПабМед Центральный Google ученый

3. Нотоми Т., Окаяма Х., Масубучи Х., Йонекава Т., Ватанабэ К., Амино Н. и др. Петлевая изотермическая амплификация ДНК. Нуклеиновые Кислоты Res. 2000;28:e63. https://doi.org/10.1093/нар/28.12.e63.

   КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

4. Amaral C, Antunes W, Moe E, Duarte AG, Lima LMP, Santos C, et al. Молекулярный тест на основе RT-LAMP для быстрого, чувствительного и недорогого колориметрического обнаружения SARS-CoV-2 в клинических образцах. Научный доклад 2020; 11: 1–12. https://doi.org/10.1038/s41598-021-95799-6.

   КАС Статья Google ученый

5. Tanner NA, Zhang Y, Evans TC Jr. Визуальное обнаружение изотермической амплификации нуклеиновых кислот с использованием рН-чувствительных красителей. Биотехнологии. 2015;58(2):59–68. https://doi.org/10.2144/000114253.

   КАС Статья пабмед Google ученый

6. Томита Н., Мори Ю., Канда Х., Нотоми Т. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) последовательностей генов и простое визуальное обнаружение продуктов. Нат Проток. 2008; 3: 877–82. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.57.

   КАС Статья пабмед Google ученый

7. Яникова М., Ходоси Дж., Бур П., Клемпа Б., Селек П. Петлевая изотермическая амплификация для обнаружения SARS-CoV-2 в слюне. Микроб Биотехнология. 2021; 14: 307–16. https://doi.org/10.1111/1751-7915.13737.

   КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

8. Перес В.П., Пессоа В., Гальван Б., Соуза Э., Дежани Н.Н., Кампана Э.Х. и др. Оценка альтернативных методов выделения РНК для обнаружения SARS-CoV-2 в образцах носоглотки с использованием рекомендованного CDC набора праймер-зонд. Джей Клин Вирол. 2021;1:100032. https://doi.org/10.1016/j.jcvp.2021.100032.

   Артикул Google ученый

9. Лау Ю.Л., Исмаил И., Мустапа Н. И., Лай М.Ю., Туан Сох Т.С., Хассан А. и др. Изотермическая амплификация, опосредованная петлей обратной транскрипции, в режиме реального времени для быстрого обнаружения SARS-CoV-2. Пир Дж. 2020;8:e9278. https://doi.org/10.7717/peerj.9278.

   КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

10. Yan C, Cui J, Huang L, Du B, Chen L, Xue G и др. Быстрое и визуальное обнаружение 2019 годановый коронавирус (SARS-CoV-2) с помощью анализа изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции. Клин Микробиол Инфект. 2020; 26: 773–9. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2020.04.001.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

11. Флинн М.Дж., Ницер О.С., Флинн Дж., Грин С., Елин И., Шварцворт-Коэн М. и др. Простая прямая RT-LAMP диагностика SARS-CoV-2 по слюне. препринт medRxiv. 2020 г. https://doi.org/10.1101/2020.11.19.20234948.

12. Anahtar MN, McGrath GEG, Rabe BA, Tanner NA, White BA, Lennerz JKM, et al. Клиническая оценка и валидация быстрого и чувствительного теста на SARS-CoV-2 с использованием изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции, без необходимости выделения РНК. Открытый форум Infect Dis. 2021;8(2):ofaa631. https://doi.org/10.1093/ofid/ofaa631.

    КАС Статья пабмед Google ученый

13. Dao Thi VL, Herbst K, Boerner K, Meurer M, Kremer LP, Kirrmaier D, et al. Колориметрический анализ RT-LAMP и LAMP-секвенирование для обнаружения РНК SARS-CoV-2 в клинических образцах. Sci Transl Med. 2020;12:eabc7075. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abc7075.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

14. Aoki MN, de Oliveira CB, Góes LGB, Minoprio P, Durigon EL, Morello LG, et al. Колориметрическая диагностическая чувствительность RT-LAMP SARS-CoV-2 зависит от интерпретации цвета и вирусной нагрузки. Научный представитель 2021; 11:9026. https://doi.org/10.1038/s41598-021-88506-y.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

15. Ву С., Лю С., Е С., Лю Дж., Чжэн В., Донг С. и др. Колориметрическое изотермическое обнаружение нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 с комбинацией красителей. Гелион. 2021;7(4):e068862. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e06886.

    КАС Статья Google ученый

16. Чжан Ю., Рен Г., Басс Дж., Барри А.Дж., Паттон Г.К., Таннер Н.А. Повышение скорости и чувствительности изотермической амплификации, опосредованной колориметрической петлей, с помощью хлорида гуанидина. Биотехнологии. 2020;69: 178–85. https://doi.org/10.2144/btn-2020-0078.

    КАС Статья пабмед Google ученый

17. «>

    Fu S, Jiang Y, Jiang X, Zhao Y, Chen S, Yang X и др. Беззондовая система маркировки для быстрого обнаружения рода Cronobacter в сухой детской смеси. АМБ Экспресс. 2018;8:155. https://doi.org/10.1186/s13568-018-0689-x.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

18. Гарсия-Берналт Диего Х., Фернандес-Сото П., Крего-Висенте Б., Алонсо-Кастрильехо С., Фебрер-Сендра Б., Гомес-Санчес А. и др. Прогресс в анализе петлевой изотермической амплификации для обнаружения ДНК Schistosoma mansoni : к готовому к использованию тесту. Научный доклад 2019; 9: 14744. https://doi.org/10.1038/s41598-019-51342-2.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

Скачать ссылки

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Генерального директора Министерства здравоохранения Малайзии за его разрешение опубликовать эту статью.

Финансирование

Это исследование было поддержано Схемой грантов на исследования прототипов (PRGS), PR001-2020B (PRGS/2/2020/SKK09/UM/02/1) Министерства образования Малайзии.

Информация об авторе

Авторы и организации

1. Кафедра паразитологии, медицинский факультет, Малайский университет, 50603, Куала-Лумпур, Малайзия

   Менг Йи Лай, Фатма Дияна Мохд Бухари, Нур Зулейха Зулкефли и Йи Линг Лау

2. Отделение патологии, больница Сунгай Булох, Министерство здравоохранения, Куала-Лумпур, Малайзия

   Илияна Исмаил, Сунур Изатиан, Тунур Изатиан Soh & Afifah Haji Hassan

3. Институт клинических исследований Национального института здравоохранения Министерства здравоохранения, Куала-Лумпур, Малайзия

   Kalaiarasu M. Peariasamy

4. Центр клинических исследований, больница Sungai Buloh, Министерство здравоохранения, Куала-Лумпур, Малайзия

   Yee Leng Lee

5. Отделение вирусологии, Исследовательский центр инфекционных заболеваний, Институт медицинских исследований, Национальные институты здравоохранения, Министерство здравоохранения, Куала-Лумпур , Малайзия

   Джеянти Суппиа и Равиндран Тайан

6. Selia-Tek Holdings Sdn Bhd, Lot 18, Jalan Teknologi 3/5, Taman Sains Selangor, 47810, Kota Damansara, Selangor, Malaysia

   Мохд Хайри Мат Иса и Нур Зафира Абдул Вахид

Авторы

1. Менг Йи Лай

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

2. Fatma Diyana Mohd Bukhari

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

3. Нур Зулайха Зулкефли

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

4. Илиана Исмаил

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

5. Нур Изати Мустапа

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

6. Tuan Suhaila Tuan Soh

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

7. Afifah Haji Hassan

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

8. Kalaiarasu M. Peariasamy

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

9. Yee Leng Lee

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

10. Jeyanthi Suppiah

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

11. Ravindran Thayan

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

12. Mohd Khairi Mat Isa

    Посмотреть публикации автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

13. Нур Зафира Абдул Вахид

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

14. Yee Ling Lau

    Просмотр публикаций автора

    Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

Вклады

MYL, FDMB и NZZ написали рукопись и внесли свой вклад в разработку исследования. II, NIM, TSTS, AHH, KMP, YLL, JS, RT, MKMI и NZAW собрали данные и подтвердили диагноз пациента. MYL и YLL проанализировали данные. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Автор, ответственный за переписку

Переписка с Йи Лин Лау.

Декларация этики

Одобрение этики и согласие на участие

Одобрение этики и согласие на участие Формы информированного согласия были получены от всех участников исследования. От всех участников исследования были получены формы информированного согласия. Это исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике Медицинского центра Малайского университета (UMMC) (202041-8418) и Комитетом по этике медицинских исследований (MREC) Министерства здравоохранения Малайзии (NMRR-20-2344-569).94). Все методы и процесс получения информированного согласия проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и положениями Комитета по медицинским исследованиям и этике Министерства здравоохранения Малайзии.

Согласие на публикацию

Неприменимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой рукописи.

Дополнительная информация

Примечание издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Дополнительная информация

Дополнительный файл 1.

Результат RT-qPCR и RT-LAMP для 260 образцов.

Права и разрешения

Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате при условии, что вы укажете соответствующую ссылку на оригинальный автор(ы) и источник, предоставьте ссылку на лицензию Creative Commons и укажите, были ли внесены изменения.

Добавить комментарий Отменить ответ

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Комментарий *

Имя *

Email *

Сайт